Czy Challenge test to rzeczywiście wyzwanie?

Testy sprawdzające (Challenge test) zdolność wzrostu lub przeżywania wprowadzonych do produktów mikroorganizmów mogących stanowić zanieczyszczenie produktów, w różnych dających się racjonalnie przewidzieć warunkach przechowywania (Rozporządzenie 2073/2005, załącznik II). Stanowią one dodatkowe badania (art. 3, ust. 2 ww. Rozporządzenia), które przedsiębiorca sektora spożywczego odpowiedzialny za wytwarzanie produktu (jeśli jest to konieczne), powinien prowadzić w celu zbadania zgodności z kryteriami w ciągu całego okresu przydatności do spożycia.

Challenge test – to eksperymentalne metody badające zachowanie mikroorganizmów dodanych do produktu w postaci inokulum (zawiesiny drobnoustrojów). Challenge test można przeprowadzić na dwa sposoby: z oceną potencjału wzrostu lub z oceną czasu trwania lag fazy i tempa wzrostu.
Na podstawie wyników Challenge test z oceną potencjału wzrostu stwierdza się, czy w badanym produkcie możliwy jest, czy też nie jest możliwy wzrost wprowadzonego mikroorganizmu w różnych warunkach występujących w cyklach dystrybucji produktu. Wynik testu obciążeniowego to potencjału wzrostu (∆), który stanowi też wprost kryterium podziału produktów żywnościowych, w szczególności wyrobów gotowych, które mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego ze względu na obecność Listeria monocytogenes. Produkty RTE kwalifikuje się, na tej podstawie do jednej z dwóch kategorii żywności (Tab. 1A):
– 1.2 – żywność, w której możliwy jest wzrost Listeria monocytogenes (+∆) lub
– 1.3 – żywność, w której wzrost Listeria monocytogenes jest niemożliwy (-∆).

Protokół postępowania przewiduje inokulację produktu znaną liczbą patogenu (zwykle 2 log jtk/g) następnie w okresie przydatności do spożycia obserwuje się rozwój L. monocytogenes (min. 5 obserwacji w tym 1 na początku i 1 na końcu TPS). Następnie obliczana jest różnica pomiędzy najwyższą oznaczoną w teście liczbą patogenu a liczbą początkową. Obliczona różnica to potencjał wzrostu ∆. Najczęściej przyjmowana interpretacja mówi, że jeśli wynik odejmowania wynosi powyżej 0,5 log jtk/g to potencjał wzrostu jest dodatni (+∆), i produkt kwalifikowany jest do kategorii 1.2, natomiast jeśli wynik odejmowania wynosi poniżej 0,5 log jtk/g potencjał jest ujemny (-∆) i produkt otrzymuje kategorię 1.3.
W dniu 20.11.2024 nastąpiła istotna zmiana w Rozporządzeniu (WE) 2073/2005 wprowadzona Rozporządzeniem Komisji (UE) 2024/2895) w kategorii 1.2 produktów żywnościowych na „etapie stosowania kryterium” (Tab. 1B-ostatnia kolumna). Mianowicie wprowadzone zostaje kryterium „braku wykrycia” L. monocytogenes w produktach producenta wprowadzanych do obrotu w ciągu okresu przydatności do spożycia, jeżeli przedsiębiorstwo sektora spożywczego będące producentem nie było w stanie wykazać w sposób zadowalający dla właściwego organu, że poziom L. monocytogenes nie przekroczy limitu 100 jtk/g w całym okresie przydatności do spożycia żywności (***).

Celem wprowadzanej zmiany jest zagwarantowanie takiego samego poziomu ochrony zdrowia publicznego od produkcji do dystrybucji żywności gotowej do spożycia, innej niż żywność przeznaczona dla niemowląt i żywność specjalnego przeznaczenia medycznego (kat. 1.1, zał. I), mogącej umożliwiać wzrost Listeria monocytogenes poprzez wprowadzenie kryterium bezpieczeństwa żywności „Listeria monocytogenes – nie wykryto w 25 g” które powinno mieć zastosowanie do wszystkich sytuacji, w których żywność ta jest wprowadzana do obrotu w ciągu jej okresu przydatności do spożycia i w przypadku których producent nie był w stanie wykazać w sposób wymagany przez właściwy organ, że poziom Listeria monocytogenes nie przekroczy limitu 100 jtk/g w całym okresie jej przydatności do spożycia.
Test obciążeniowy prowadzony z oceną czasu trwania lagfazy i maksymalnego tempa wzrostu pozwala wykazać, że w okresie przydatności produktu limit 100 jtk/g L. monocytogenes nie zostanie przekroczony. Z wykorzystaniem metodologii mikrobiologii predyktywnej oblicza się długość lagfazy i tempo wzrostu populacji. Tempo wzrostu jest to charakterystyka populacji mówiąca o tym, ile komórek (log jtk/g) wzrośnie populacja w jednostce czasu, najczęściej w ciągu godziny. Uzyskując informacje mówiąca, że tempo wzrostu patogenu w produkcie wynosi np. 0,023 log jtk/h można obliczyć jaki czas 2/0,023=87h zajmie populacji osiągniecie limitu log 2 jtk/g. Po uwzględnieniu czasu trwania lagfazy (czas potrzebny populacji drobnoustrojów do rozpoczęcia namnażania) można precyzyjne wyznaczyć czas do osiągnięcia ustanowionego w Rozporządzeniu Komisji (UE) 2024/2895 limitu 100 jtk/g (log 2 jtk/g). Z powyższego wynika przydatność i znaczenie testów obciążeniowych w szacowaniu terminu trwałości i bezpieczeństwa mikrobiologicznego produktu. Laboratorium ProgFood specjalizuje się w opracowywaniu matematycznych modeli predyktywnych.

Szczegółowe wytyczne dotyczące przeprowadzenia Challenge znajdują się w EURL Lm Technical Guidance Document on Challenge tests and durability studies for assessing shelf-life of ready-to-eat foods related to Listeria monocytogenes (EC/DG SANCO v. 4 of 1 July 2021) oraz w przypadku zagrożeń mikrobiologicznych innych niż L. monocytogenes stosuje się wytyczne normy EN ISO 20976-1 „Wymagania i wytyczne dotyczące przeprowadzania testów obciążeniowych produktów spożywczych i paszowych – Część 1: Testy obciążeniowe do badania potencjału wzrostu, czasu lagfazy i maksymalnego tempa wzrostu” opublikowanej w 2019 roku. Norma określa protokoły przeprowadzania testów obciążeniowych w celu badania wzrostu bakterii i drożdży, które nie tworzą grzybni. Wytyczne Techniczne EURL Lm powinny być odczytywane w połączeniu z Normą i traktowane jako dokument uzupełniający normę EN ISO 20976-1.
Przedsiębiorstwa sektora spożywczego mogą współpracować w prowadzeniu badań obciążeniowych z laboratoriami prowadzącymi tego rodzaju badania. Zgodnie z wymaganiami przewodnika EURL Lm Guidance Document to evaluate the competence of laboratories implementing Challenge tests and durability studies related to Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods v. 3 10/02/2023 zaleca się, aby laboratorium posiadało akredytację w zakresie:
– wykrywania i oznaczania liczby L. monocytogenes w żywności. Stosowane metody powinny spełniać wymagania określone w art. 5 rozporządzenia (WE) nr 2073/2005,
– pomiarów parametrów fizykochemicznych (tj. aktywności wody i pH) oraz analiz mikrobiologicznych przydatnych do interpretacji wyników testu obciążeniowego.

W przypadku laboratorium nieakredytowanego minimalny oczekiwany poziom zapewnienia jakości w zakresie prowadzenia Challenge test to:
– posiadanie udokumentowanych dobrych praktyk laboratoryjnych,
– wykonywanie testów metrologicznej kontroli jakości,
– pomyślne uczestnictwo w badaniach biegłości.

Czas wykonania przez laboratorium testu obciążeniowego jest zdeterminowany terminem przydatności badanego produktu. Etapy wykonania Challenge test to:
1. Zgłoszenie informacji do laboratorium jaki produkt podlegać będzie badaniom. Szczególnie istotne jest podanie następujących informacji:
– Zakres badania (pojedynczy produkt/ produkt reprezentujący gamę produktów),
– Identyfikacja produktu (nazwa, gramatura, temperatura przechowywania, skład/lista składników, data ważności, zdjęcie produktu i etykiety),
– Okres przydatności produktu do spożycia (data produkcji, przewidywany mikrobiologiczny okres trwałości),
– Historia produktu (nowy produkt, produkt obecny na rynku),
– Proces produkcji (główne etapy związane z inaktywacją mikroorganizmów lub możliwym ponownym skażeniem),
– Pakowanie produktu (właściwości materiału opakowaniowego np. przepuszczalność, rodzaj atmosfery: powietrze atmosferze/próżnia/skład atmosfery modyfikowanej),
– Właściwości fizykochemiczne produktu: pH, aw lub sól w fazie wodnej, stężenie konserwantów (dane dla każdego czynnika: wartość, zakres, średnia, odchylenie standardowe),
– Mikrobiologiczne właściwości produktu:
– Dane dotyczące L. monocytogenes (liczba, okres objęty badaniem, częstość występowania, poziom zanieczyszczenia, dane przekraczające limit 100 jtk/g),
– Dane dotyczące mikroorganizmów (innych niż L. monocytogenes) o istotnym znaczeniu: ogólna liczba drobnoustrojów, bakterie kwasu mlekowego, mikroflora technologiczna (dodatek probiotyków, kultur starterowych),
– Charakterystyka łańcucha chłodniczego. Temperatura i czas przechowywania: na etapie produkcji, od produkcji do sprzedaży detalicznej, w sprzedaży detalicznej, na poziomie konsumenta,
– Przeznaczenie produktu (rynek krajowy i/lub inne państwa członkowskie UE).

2. Wykonanie analiz przez laboratorium wg PN-EN ISO 20976-1 oraz wymagań EURL Lm Technical Guidance Document przy założeniu minimalnej liczby testów (Ryc. 1.).
3. Wydanie raportu przez laboratorium po zakończeniu badania, który przedstawia cel testu obciążeniowego, warunki, w których przeprowadzono test, uzyskane wyniki i wnioski oraz podstawę prowadzenia testów obciążeniowych (EN ISO 20970-1 i wytycznych technicznych EURL Lm).

Przeprowadzenie Challenge test to wyzwanie dla producentów żywności. Jednak dzięki nim mogą w oparciu o naukowe podstawy wykazać zgodność produktu z wymaganymi kryteriami bezpieczeństwa żywności gwarantującymi zdrowie publiczne i wyznaczyć precyzyjnie (zoptymalizować) termin przydatności do spożycia swoich produktów. Challenge test pozwala również potwierdzić skuteczność działania zastosowanych środków konserwujących, nowych technologii produkcji czy pakowania.

dr inż. Elżbieta Rosiak
www.progfood.pl